焦虑症（anxiety disorder）是一种以焦虑情绪为主的神经疾病，以持续性的焦虑、紧张、惊恐不安等情绪为表现，并伴有自主神经紊乱、肌肉紧张以及运动不安等症状[1]。世界卫生组织（WHO）的调查结果显示，我国焦虑症的12个月患病率为3.0%，终生患病率为4.8%[2]；对于特定人群（如冠心病患者、临考学生等），患病比例可达10%以上[1]。苯二氮䓬类药物（如地西泮）和5-羟色胺再摄取抑制剂（如丁螺环酮）为现阶段临床常用药物，此类药物虽疗效显著，但常见成瘾性，并易引起头痛、胃肠功能紊乱等不良反应[3]。而中药治疗焦虑症具有效用显著、价格低廉、不良反应小等优势，如复方抗焦虑胶囊[4]、柴胡疏肝散[5]、石菖蒲[6]等。因而，从临床常见中药中筛选抗焦虑药物具有重要意义。
药对理论形成并脱胎于《神农本草经》[7]，酸枣仁与五味子合用能补心气、安心神[8]，用于治疗失眠、健忘、焦虑等。其中，酸枣仁（Ziziphi Spinosae Semen，SZR）来源于鼠李科植物酸枣Ziziphus jujubaMill. var. spinosa(Bunge) Hu ex H. F. Chou的干燥成熟种子[9]，药用历史悠久，具有养心补肝、宁心安神、敛汗、生津的功效，属药食同源中药，主要含黄酮、三萜皂苷、生物碱等成分。五味子（Schisandrae Chinensis Fructus，WWZ）是木兰科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill. 的干燥成熟果实[9]，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，主要含木脂素、挥发油、降三萜等成分，在我国的应用地域贯穿南北，服务于人口众多的满族[10]、蒙古族[11]、瑶族[12]，不仅是常见的中药，也是常用的民族药。
酸枣仁-五味子在临床上常相须为用，配伍比例以1∶1和2∶1为主[7]。课题组前期研究发现，炒酸枣仁-醋五味子2∶1配伍时，具有显著的抗焦虑作用[13]。斯皮诺素是酸枣仁的质控指标之一[9]，为黄酮碳苷，主要通过调节γ-氨基丁酸A型受体（gamma- aminobutyric acid type A receptor，GABAAR）及5-羟色胺1A型受体（5-hydroxytryptamine 1A receptor，5-HT1AR）发挥抗焦虑作用[14]。五味子醇甲是五味子的质控指标[9]，属木脂素，可对抗咖啡因、苯丙胺对自主活动的兴奋作用，抑制小鼠由电刺激或长期单居引起的激怒行为；有广泛的中枢抑制作用，并有安定药的作用特点[15]。酸枣仁-五味子（5∶1）配伍前后斯皮诺素[16]和五味子醇甲[17]的吸收、消除情况已有报道，但目前尚无对酸枣仁-五味子（2∶1）这一临床常用比例配伍前后在焦虑模型动物中肠吸收特性变化的研究，二者配伍的肠吸收机制尚不明确。
为探究酸枣仁-五味子（2∶1）配伍抗焦虑药效的发挥与特征成分吸收之间的关系，本研究采用已被广泛证实有效的空瓶应激（empty bottle stress，EBS）大鼠焦虑模型和孤养结合束缚应激（restraint stress，RS）大鼠焦虑模型[18-21]，从躯体、社会和心理3个方面[22]进行焦虑的诱导。选择重复性好、操作简便、能避免个体差异[23]的离体外翻肠囊实验和能准确反映大鼠给药后体内吸收情况的在体单向肠灌流实验，考察酸枣仁-五味子（2∶1）配伍对斯皮诺素和五味子醇甲在十二指肠、空肠、回肠及小肠总的吸收量、吸收速率常数（absorption rate constant，Ka）和表观渗透系数（apparent permeability coefficient，Papp）的影响，从肠吸收屏障网络[24]的角度揭示酸枣仁-五味子（2∶1）配伍后抗焦虑药效增强的机制，为临床用药提供理论和实验依据。
结果
各提取物出膏率及配伍对指标成分溶出的影响
酸枣仁、五味子、酸枣仁-五味子提取物的平均出膏率（由同一批药材分别提取20次计算得到）分别为11.60%、32.10%和17.08%。
经HPLC测定，肠吸收实验中的酸枣仁供试液中含斯皮诺素9.19 µg/mL，五味子供试液中含五味子醇甲295.59 µg/mL，酸枣仁-五味子供试液中含斯皮诺素17.02 µg/mL、五味子醇甲268.74 µg/mL。液相测定结果可见，斯皮诺素在配伍后供试液中的含量与配伍前相比，提高了约1倍，说明配伍能增加斯皮诺素的溶出。
酸枣仁-五味子配伍前后对焦虑模型大鼠焦虑行为的影响
旷场实验结果
如图1所示，与对照组相比，EBS和RS模型大鼠均表现出焦虑样行为，体现在进入旷场中央区的次数和停留时间减少（P＜0.05、0.01）。
在EBS和RS模型下，与模型组相比，阳性药组大鼠进入中央区的次数和停留时间明显增加（P＜0.05、0.01），说明阳性药干预并改善了模型大鼠的焦虑状态。除阳性药组外，各给药组大鼠进入中央区的次数和在中央区停留的时间与模型组相比，均有不同程度的增加，其中，配伍组较模型组增加最多（P＜0.05）。EBS和RS焦虑模型大鼠的旷场实验结果一致，证实了酸枣仁、五味子单用及配伍给药后能不同程度地改善焦虑模型大鼠的焦虑状态，且配伍后改善焦虑状态的趋势更为明显（P＜0.05）。
高架十字迷宫实验结果
如图2所示，与对照组相比，EBS和RS模型大鼠均表现出焦虑样行为，体现在进入开臂的次数和时间百分比降低（P＜0.05、0.01）。与模型组相比，阳性药组大鼠进入开臂的次数和时间百分比均增加（P＜0.05、0.01），说明阳性药干预改善了模型大鼠的焦虑状态。
在EBS和RS焦虑模型下，各给药组大鼠与模型组相比，进入开臂的次数均明显增加（P＜0.05、0.01），说明酸枣仁、五味子单用及配伍给药均能改善焦虑模型大鼠的焦虑表现；各给药组大鼠与模型组相比，进入开臂时间百分比有不同程度增加，并且配伍后相对于配伍前增加更多，其中，EBS模型下的配伍组大鼠进入开臂时间百分比与模型组相比有明显增加（P＜0.05）。
EBS和RS焦虑模型的高架十字迷宫实验结果基本一致，表明酸枣仁、五味子单用及配伍给药后能不同程度地改善焦虑模型大鼠的焦虑状态，并且在EBS模型下，配伍后改善焦虑状态的趋势更为明显（P＜0.05、0.01）。
以上行为学数据表明，酸枣仁、五味子配伍后较配伍前更能增加大鼠进入旷场中央区的次数和时间，以及进入开臂的时间。说明酸枣仁、五味子配伍后较配伍前更能改善焦虑模型大鼠的焦虑状态，更好地发挥抗焦虑药效。
HPLC方法学考察结果
专属性考察结果表明斯皮诺素与五味子醇甲分离良好，无溶剂干扰（图3）。精密度和重复性考察结果斯皮诺素、五味子醇甲的峰面积RSD均小于2.0%，说明精密度和重复性符合要求。线性关系考察结果分别为斯皮诺素回归方程Y＝39 338 X－19 770，R2＝0.999，线性范围为0.5～30 μg/mL；五味子醇甲回归方程Y＝9 984.3 X－94 449，R2＝0.999，线性范围为10～600 μg/mL。斯皮诺素、五味子醇甲的定量限分别为0.24、0.05 μg/mL。空白加样回收率实验结果表明，斯皮诺素和五味子醇甲在各个样品中的加样回收率范围为91.81%～115.34%，RSD分别为0.05%、0.04%、0.93%和0.33%，回收率符合80%～120%标准，RSD均小于2%，结果符合要求。
外翻肠囊样品稳定性考察结果（表1）表明，配伍前后各肠段样品中的斯皮诺素在24 h内均有较高的稳定性（含量变化比不超过5.49%，峰面积RSD不超过2.15%）；配伍前后五味子醇甲在十二指肠中均稳定（含量变化比不超过1.00%，RSD不超过0.38%），但配伍前五味子醇甲在空肠和回肠样品中24 h内不稳定，含量变化比分别为−14.36%、27.41%，峰面积RSD已超过7.94%，而配伍后稳定性显著提高（含量变化比降低至2.54%，RSD降低至0.95%）。在体单向肠灌流样品稳定性考察结果显示，斯皮诺素和五味子醇甲在配伍前后均有较高的稳定性（含量变化比不超过4.52%，RSD不超过1.47%）。
含量变化比＝(24 h含量－0 h含量)/ 0 h含量
各成分在空白肠囊吸收液中的稳定性考察结果
在十二指肠、空肠和回肠样品中，斯皮诺素孵育0.5、2 h的剩余率为89.83%～106.13%，五味子醇甲孵育0.5、2 h的剩余率为92.59%～96.18%；在空白肠囊吸收液中孵育2 h，考察化合物的损失及误差范围约在10%以内，稳定性尚可。
各成分在空白肠灌流液中的稳定性考察结果
酸枣仁提取物和酸枣仁-五味子提取物中的斯皮诺素分别经空白肠灌流液溶解、孵育0.5、2 h的剩余率为99.26%～99.80%；五味子提取物和酸枣仁-五味子提取物中的五味子醇甲分别经空白肠灌流液溶解、孵育0.5、2 h的剩余率为99.51%～100.96%；在空白肠灌流液中孵育2 h，考察化合物的损失及误差范围约在1%以内，稳定性较高。
各成分在肠壁的物理吸附性考察结果
斯皮诺素和五味子醇甲在肠壁的物理吸附性考察结果如表2所示。影响吸附后与吸附前含量比值（简称比值）的因素包括2方面：①肠壁对该成分的物理吸附作用；②肠壁对供试液中水分的吸收作用。
首先，酸枣仁单用时，斯皮诺素在回肠的吸附比值为98.30%，在其他肠段均高于100%，说明酸枣仁单用时，斯皮诺素在回肠肠壁有略微的吸附，在其他肠段吸附作用不明显。五味子单用时，五味子醇甲在十二指肠、空肠和回肠的比值分别为74.80%、102.61%和89.35%，说明五味子单用时，十二指肠和回肠对五味子醇甲有较强的吸附作用，且十二指肠的吸附更甚，空肠对其没有明显的吸附作用。配伍后，肠壁对斯皮诺素和五味子醇甲的吸附作用可能减弱（各肠段比值均高于配伍前），或更多地表现为对供试液中水分的吸收，进而导致供试液浓缩，使比值增加，高于100%。综上，配伍可能降低十二指肠对五味子醇甲、回肠对斯皮诺素和五味子醇甲的物理吸附作用，也可能提高各肠段对供试液中水分的吸收。
斯皮诺素和五味子醇甲在离体外翻肠囊实验中的结果
酸枣仁-五味子配伍前后给药对EBS和RS模型大鼠离体外翻肠囊实验中斯皮诺素和五味子醇甲的肠吸收特性影响如表3所示。可以看出，五味子醇甲的吸收量比斯皮诺素整体约高1个数量级；在EBS和RS模型下，配伍前的斯皮诺素和五味子醇甲在回肠肠段吸收量均高于其他肠段；配伍后，二者在各肠段的吸收量相当，其中，斯皮诺素在回肠肠段的吸收量略低于其他两肠段。
在离体外翻肠囊实验中，酸枣仁、五味子配伍后斯皮诺素和五味子醇甲的肠吸收量变化情况如表4所示。配伍后，除RS模型的空肠肠段外，斯皮诺素在两模型下的各肠段的吸收量均降低，EBS模型下总吸收量降低38.88 µg，RS模型下总吸收量降低3.92 µg。配伍后，五味子醇甲在两模型下的小肠总吸收量较配伍前均有所增加，事实上，除回肠段外，五味子醇甲的吸收量均增加，EBS模型下总吸收量增加45.29 µg，RS模型下总吸收量增加221.81 µg，约增加1倍。以上结果说明配伍降低了斯皮诺素的吸收，但促进了五味子醇甲在十二指肠和空肠的吸收。从数值来看，配伍促进五味子醇甲增加的吸收量大于斯皮诺素降低的吸收量，尤其在RS模型下，五味子醇甲的吸收增加量（221.81 µg）远大于斯皮诺素的吸收降低量（3.92 µg）。
Q变化量=配伍后Q－配伍前Q
斯皮诺素在在体单向肠灌流实验中的结果
酸枣仁-五味子配伍前后给药，对EBS和RS模型大鼠在体单向肠灌流实验中斯皮诺素的肠吸收特性如表5所示。峰面积比值越小，表明吸收越好；Ka值越大，表明吸收越快；Papp是衡量物质渗透性的参数，通常该参数的数值越大，表明物质越易于渗透，即易于吸收，有研究者[27]认为当Papp大于4×10−4 cm/min时，说明该物质有较好的吸收。
在EBS和RS焦虑大鼠模型下，灌流的前2个时段（0～30 min）中，配伍前后斯皮诺素的峰面积比值均不高于4.97%，说明供试液中的斯皮诺素近完全吸收，随着灌流过程的推进（30～60 min），峰面积比值逐渐增加，甚至达到128.03%，样品吸收逐渐减弱，甚至出现了外排现象。在30～60 min时段内，在EBS模型下，配伍后斯皮诺素的峰面积比值明显大于配伍前，说明配伍后斯皮诺素的吸收降低，此结果与离体外翻肠囊实验的结果一致；而在RS模型下，配伍后斯皮诺素的峰面积比值降低，其变化趋势与之相反，原因有待进一步讨论。
在EBS和RS焦虑大鼠模型下，斯皮诺素在配伍前后的绝大部分吸收时段（RS-酸枣仁的45～60 min时段除外）的Ka均不低于11.70×10−3/min，Papp均不低于1.85×10−3 cm/min，表明斯皮诺素在两模型下的吸收速率较快，且吸收良好[27]。在0～30 min时段，配伍后，两焦虑模型下斯皮诺素的Ka和Papp均有升高趋势，说明配伍可能促进斯皮诺素的初始（0～30 min）吸收。而在30～60 min时段，在EBS模型下，配伍后斯皮诺素的Ka和Papp均有不同程度降低，说明配伍后斯皮诺素的吸收降低；而在RS模型下，斯皮诺素的Ka和Papp均明显升高，其变化趋势与之相反，原因有待进一步讨论。值得注意的是，酸枣仁单独给药（RS-酸枣仁）至45～60 min时，峰面积比值大于100%，Ka和Papp均呈负值，说明此时机体对斯皮诺素的处理以外排为主，且这种外排现象在配伍后（RS-配伍）得到改善。
以上现象表明，在肠吸收初期（0～30 min），配伍给药可能促进斯皮诺素的吸收，但在后期（30～60 min），配伍可能导致其吸收降低；除此之外，配伍还能减轻小肠对斯皮诺素的外排作用。
五味子醇甲在在体单向肠灌流实验中的结果
酸枣仁-五味子配伍前后给药，对EBS和RS模型大鼠在体单向肠灌流实验中五味子醇甲的肠吸收特性结果如表6所示。在EBS和RS焦虑大鼠模型中，配伍前后供试液中的五味子醇甲在灌流的全过程近完全吸收（峰面积比值极小），并且随着灌流过程的推进，样品吸收没有减弱的趋势（峰面积比值没有明显增加，均小于1%），持续保持较高的吸收；各个吸收时段的Ka均不低于0.013 50/min，Papp均大于5.75×10−3cm/min，表明五味子醇甲在两模型下的吸收速率较快，且吸收良好[27]。
并且配伍给药后，两模型下五味子醇甲在各时段的Ka和Papp均不同程度升高，说明配伍可能促进五味子醇甲的吸收。其中，EBS模型下五味子单独给药（EBS-五味子）组的Ka有较大的标准误差，此现象可能与灌流前后灌流液体积、密度的变化及小肠长度的差异有关，而肠道对水分的交换和利用或许是以上差异在大鼠体内的表现形式。以上现象表明，五味子醇甲在配伍前后均保持较高水平的吸收，且配伍能促进五味子醇甲的吸收。
综合肠吸收实验结果显示，配伍前后，斯皮诺素和五味子醇甲的吸收情况均较好，且五味子醇甲的小肠总吸收量远高于斯皮诺素（约高1个数量级）；配伍可能促进斯皮诺素的初始吸收（0～30 min），但降低后期（30～60 min）的吸收，并降低斯皮诺素的小肠总吸收量；另外，配伍能减轻酸枣仁中斯皮诺素的外排作用，并促进五味子中五味子醇甲的吸收。以上结果说明酸枣仁、五味子抗焦虑药效的发挥与其药效物质斯皮诺素、五味子醇甲良好的吸收密不可分；配伍后抗焦虑作用的增强可能与促进五味子醇甲的吸收有关。
讨论
本研究采用EBS和RS 2种焦虑大鼠模型，通过离体外翻肠囊实验和在体单向肠灌流实验结合HPLC法，分别考察了酸枣仁-五味子药对在配伍前后的指标成分斯皮诺素和五味子醇甲在焦虑模型大鼠中的肠吸收特性。结果表明，酸枣仁-五味子配伍前后，斯皮诺素和五味子醇甲均保持良好的吸收，在此基础上抗焦虑作用得以发挥；配伍虽增加了斯皮诺素的溶出量，减少了小肠对斯皮诺素的外排，但降低了斯皮诺素的吸收。配伍促进了五味子醇甲的吸收，并增加了其在空肠和回肠中的稳定性，因此，本研究认为五味子醇甲是配伍后抗焦虑药效增强的重要物质基础。
酸枣仁-五味子配伍抗焦虑指标成分的选择
斯皮诺素有广泛的中枢药理作用，如镇静催眠、抗焦虑等[28]，研究证实其抗焦虑机制由GABAAR和5-HT1AR调节[14]。除斯皮诺素外，酸枣仁的质控指标还有酸枣仁皂苷A，但其不能透过血脑屏障与GABA受体完全结合[29]，经大鼠胃肠代谢后生物利用度非常低（1.32%）[30]。另有研究推测黄酮类成分可能是酸枣仁中的主要抗焦虑成分[31]，因此，本研究仅考察了酸枣仁中黄酮类化合物斯皮诺素的肠吸收特性。
五味子醇甲为木脂素类化合物，容易进入细胞内[32]，可增加大鼠纹状体及下丘脑多巴胺含量，发挥中枢抑制作用[33]，具有雌激素活性[34]，有利于避免因雌激素缺乏所致的焦虑样行为[35]。除五味子醇甲外，五味子中还含有五味子甲素和乙素，但在道地外产区外的五味子中并未检测到[36]或含量较低[37]；其药理活性与抗焦虑作用可能不直接相关，故本研究未将其纳入有效成分进行研究。
在体单向肠灌流实验中，实验大鼠禁食时间的选择
在体单向肠灌流实验，研究人员首先参考常规禁食时间[38-39]，分别尝试禁食12、18、24、36 h，但发现2种焦虑模型大鼠十二指肠处的食糜无法冲洗干净，导致灌流液不能顺畅流出，实验无法进行。并且焦虑模型大鼠暴露腹腔后可见大量分散的脂肪，推测原因是焦虑引起大鼠中脑-边缘多巴胺系统胞外多巴胺浓度减少，导致过量摄食作为补偿[40]，因而造成十二指肠处食糜较多。将禁食时间延长至48 h后，大鼠十二指肠及后续肠段的食糜可冲洗干净，因此本实验在满足动物福利最大化的前提下，根据实验需求将大鼠禁食时间调整为48 h。
在体单向肠灌流实验中，斯皮诺素的外排作用及原因分析
RS模型下的在体单向肠灌流实验30～60 min时段，斯皮诺素在配伍后峰面积比值异常降低、Ka和Papp异常升高。观察酸枣仁单独给药30～60 min时段的数据可见，此时斯皮诺素峰面积比值过高（分别为63.35%、128.03%）；Ka和Papp数值过低，甚至在45～60 min时段出现负值，说明在45～60 min时段，机体对斯皮诺素的处理以外排为主。而在30～45 min时段，推测外排作用已经发生，并导致了上述参数的异常变化。
上述外排作用在配伍后得到改善，分析其原因，斯皮诺素主要在小肠中消化吸收[41]，但生物利用度低，其外排现象与P-糖蛋白、多药耐药相关蛋白等均有关[42]；五味子中的木脂素既是P-糖蛋白的底物又是其抑制剂[43-44]，推测在配伍后，木脂素类成分与P-糖蛋白发生作用，抑制并减轻了斯皮诺素的外排。
配伍后斯皮诺素、五味子醇甲的肠吸收特性及其与抗焦虑药效增强的关联
配伍后斯皮诺素的吸收降低，对其原因进行分析发现，斯皮诺素和五味子醇甲的肠吸收过程均为主动转运[45-46]，主动转运需要细胞膜上的膜蛋白或标志酶作为载体参与到转运过程，但载体数量有限，当需要与载体结合达到转运的成分增多时，成分间的竞争导致其中部分成分不能与载体结合达到转运、吸收。因此，推测配伍后五味子中包括五味子醇甲在内的木脂素类成分与斯皮诺素竞争载体，而五味子醇甲与载体的结合能力更强，因而导致与斯皮诺素结合的载体减少，不能达到有效的转运，因而致其吸收量降低。结合斯皮诺素在配伍前保持较好的吸收及其抗焦虑药效[14,28]，提示斯皮诺素可能是酸枣仁中抗焦虑的重要成分，但并非配伍后抗焦虑药效增加的关键成分。
两肠吸收实验结果均证实，配伍促进了五味子中五味子醇甲的吸收，外翻肠囊实验表明配伍主要促进五味子醇甲在十二指肠和空肠的吸收。另外，外翻肠囊样品稳定性考察结果表明，配伍使五味子醇甲在空肠、回肠中的稳定性大幅提高，有研究[17]提示酸枣仁能显著减少五味子醇甲在动物体内的消除，增加其滞留时间。因而推测可能是酸枣仁中的某些化学成分在配伍后与五味子醇甲相互作用，增加了五味子醇甲的稳定性，或抑制其降解，因而在一定程度上促进了其吸收。
肠吸收实验中，虽然斯皮诺素的吸收降低，但五味子醇甲的吸收升高，并且在离体外翻肠囊实验中五味子醇甲总吸收量的增加远大于斯皮诺素的减少。五味子醇甲有广泛中枢抑制作用，并有安定药的作用特点，能抑制小鼠长期单居引起的激怒行为[15]。作为抗焦虑药效指标，五味子醇甲吸收量的大幅增加或许可在一定程度上拮抗斯皮诺素的外排[42,47-49]并弥补其吸收量的降低，进而保证配伍后抗焦虑药效的发挥，乃至增强。因此，本研究认为五味子醇甲或许是促使配伍后抗焦虑药效增强的重要物质基础。另一方面，五味子中的木脂素成分也被研究证实有显著的抗焦虑作用，能显著抑制束缚应激引起的焦虑症[50]，因此，配伍后抗焦虑药效的增强也可能与五味子中其他木脂素类成分的吸收变化有关。
已有的研究表明，酸枣仁与五味子合用时，能减慢斯皮诺素的代谢，提高其生物利用度[16]；枣仁安神方中的酸枣仁能显著减缓五味子中五味子醇甲的消除，延长其作用时间[17]。本实验结果表明酸枣仁-五味子配伍后，促进了五味子醇甲的吸收，并增加其在小肠中的稳定性。结合五味子醇甲的抗焦虑活性，酸枣仁-五味子配伍进而发挥更好的抗焦虑药效，可能是促进活性成分吸收和延缓其代谢共同作用的结果。
本研究从肠吸收屏障网络的角度，初步揭示了酸枣仁、五味子抗焦虑药效的发挥与其中的药效成分斯皮诺素、五味子醇甲在小肠保持良好的吸收有关；并且酸枣仁-五味子药对配伍后通过增加药效成分五味子醇甲的吸收、提高其稳定性，进而增强了抗焦虑作用。后续可对药效成分的代谢动力学进行研究，更进一步说明其生物利用度改变的原因。
利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突
参考文献（略）
来 源：刘金凤，王晓玫，李佳园，杨 雪，魏晓嘉，王雨青，吕 研，于佳禾，金重先，王春国，石晋丽．酸枣仁-五味子配伍对抗焦虑作用的影响及指标成分的肠吸收特性研究 [J]. 中草药, 2022, 53(16): 5093-5106 .